Laboratórne Výsledky: Polymerázová Reťazová Reakcia (PCR)

Obsah:

Laboratórne Výsledky: Polymerázová Reťazová Reakcia (PCR)
Laboratórne Výsledky: Polymerázová Reťazová Reakcia (PCR)

Video: Laboratórne Výsledky: Polymerázová Reťazová Reakcia (PCR)

Video: Laboratórne Výsledky: Polymerázová Reťazová Reakcia (PCR)
Video: Výuková sada pro detekci DNA vybraných druhů ryb PCR metodou_výukové video (10 minut) 2023, Marec
Anonim

Laboratórne výsledky: polymerázová reťazová reakcia (PCR)

Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je najdôležitejšou laboratórnou metódou na skúmanie jemnej molekulárnej štruktúry genetického materiálu. Skladá sa z kyseliny deoxyribonukleovej (DNA), ktorá vytvára genetický kód človeka, ale aj zvierat a rastlín.

V humánnej medicíne sa PCR používa na objasnenie dedičných chorôb a genetických problémov (riziko ochorenia, test otcovstva atď.), Ale tiež na diagnostiku mnohých infekčných chorôb. V kontexte objasňovania infekčných chorôb, na rozdiel od sérologickej diagnostiky (stanovenie protilátok proti patogénom v krvi), predstavujú metódy PCR priamu laboratórnu lekársku detekčnú metódu.

Na jednej strane je výhodou PCR rýchla dostupnosť výsledkov testu. Okrem toho sú metódy PCR zvyčajne veľmi citlivé.

navigácia

  • Pokračovať v čítaní
  • viac na túto tému
  • Rady, súbory na stiahnutie a nástroje
  • Čo je polymerázová reťazová reakcia (PCR) a čo sa skúma?
  • Ako funguje PCR?
  • Aké výsledky poskytuje PCR?
  • Existujú nejaké ďalšie zmeny v konvenčnej PCR?
  • Aké sú hlavné oblasti použitia PCR?
  • Existujú referenčné hodnoty pre výsledky testov PCR?

To znamená, že aj najmenšie množstvo genetického materiálu patogénu (baktérie, vírusy atď.) Vedie k spoľahlivo pozitívnemu výsledku v období detekcie príslušného patogénu v zodpovedajúcom testovacom materiáli. Ako vyšetrovacie materiály pre metódy PCR sa používajú predovšetkým krv, ale aj iné telesné tekutiny (spútum, moč, alkohol atď.).

Čo je polymerázová reťazová reakcia (PCR) a čo sa skúma?

Polymerázová reťazová reakcia („Polymerase Chain Reaction“- PCR) je najdôležitejšou laboratórnou metódou na skúmanie jemnej molekulárnej štruktúry genetického materiálu. Z tohto dôvodu sa tento postup vyšetrovania nazýva aj tzv

„Molekulárna diagnostika“

Základom genetického materiálu (tiež nazývaného „genetický materiál“) je špeciálna molekula s dlhým reťazcom:

„DNA“(kyselina deoxyribonukleová)

U ľudí sa genetický materiál tvorený dvojvláknovou DNA (dvoma komplementárnymi vláknami) nachádza v jadre všetkých buniek tela, pričom všetky bunky tela jednotlivca majú identický genetický materiál. Presné zloženie individuálneho genetického zloženia každého človeka je navyše jedinečné - porovnateľné s odtlačkom prsta, ktorý je pre každého človeka taktiež jedinečný.

Z tohto dôvodu sa nazýva aj genetický materiál

„Genetický kód“znamená, pretože plán všetkých štruktúr tela človeka je mapovaný v tejto šifrovanej podobe a je týmto spôsobom uložený a je možné ho odovzdať ďalej

V bunkových jadrách buniek tela je DNA v zvláštnom poradí známom ako

„Chromozómy“(dedičné telieska) sa nazývajú. U ľudí sa tieto vyskytujú vždy v pároch v bunkách tela, jeden sa dedí od matky a druhý po otcovi. V tomto zmysle obsahujú všetky bunky tela osoby celkovo 46 chromozómov - 22 párov takzvaných autozómov a jeden pár takzvaných pohlavných chromozómov

Pomocou laboratórneho procesu PCR možno na jednej strane preskúmať jemnú štruktúru ľudskej DNA, čo je dôležité pre diagnostiku chorôb alebo pre objasnenie konkrétnych otázok:

  • Objasnenie dedičných chorôb,
  • Posúdenie rizika ochorenia,
  • Skúmanie vrodených zvláštností metabolizmu,
  • forenzný (tzv. „forenzný“) rozbor (napr. dôkaz o otcovstve) a oveľa viac

Na druhej strane nielenže ľudia majú zodpovedajúce genetické zloženie, ale aj všetky formy života na Zemi majú špecifické genetické zloženie:

  • Zvieratá,
  • Rastliny,
  • Huby,
  • Baktérie,
  • Vírusy,
  • Parazity atď.

Genetická výbava týchto foriem života tiež pozostáva hlavne z DNA alebo v prípade niektorých vírusov aj z RNA (ribonukleová kyselina), ktorá je na rozdiel od DNA jednovláknová. V lekárskej diagnostike sa preto PCR používa aj na objasnenie mnohých infekčných chorôb:

  • bakteriálne infekcie (napr. tuberkulóza, bakteriálne sexuálne prenosné choroby),
  • vírusové infekcie (napr. vírusová hepatitída, HIV infekcia),
  • parazitárne infekcie (napr. malária) a oveľa viac

Ako funguje PCR?

Metódu PCR vyvinul v roku 1983 americký biochemik Kary B. Mullis a je založená v zásade na dvoch princípoch:

  • Násobenie („zosilnenie“) tiež malej časti genetického materiálu (DNA alebo RNA)
  • Detekcia a identifikácia množených ("zosilnených") produktov zosilnenia.

Na uskutočnenie PCR sú preto potrebné tieto komponenty:

  • testovací materiál (napr. vzorky krvi, buniek alebo tkanív),
  • niektoré reagenty („polymeráza“, „primér“, „nukleotidy“[to sú stavebné bloky DNA] atď.) a laboratórne vybavenie na amplifikáciu genetického materiálu
  • detekčný systém pre produkty PCR.

Pokiaľ ide o reagencie a laboratórne vybavenie potrebné na uskutočnenie PCR, je v jadre celého procesu PCR nasledujúci enzým:

Taq polymeráza

Jedná sa o enzým, ktorý sa získava z mikroorganizmu „Thermus aquarius“(Taq) - bakteriálneho kmeňa, ktorý existuje v blízkosti horúcich sopečných prameňov a dokáže prežiť prispôsobený vysokým teplotám svojho prostredia.

Špecialitou Taq polymerázy je, že tento enzým môže plniť svoju funkciu aj pri vysokých teplotách nad 50 ° C (C) - menovite

množenie („amplifikácia“) DNA

Okrem polymerázy Taq musí byť pred analýzou PCR presne definované, ktorá časť DNA sa má skúmať. Na tento účel potrebujete krátke fragmenty DNA, ktorých jemná štruktúra zodpovedá cieľovej oblasti DNA, pokiaľ ide o príslušný genetický kód („sekvencia DNA“). Tieto fragmenty DNA sa nazývajú

„Primer“sa ozval

Skutočný proces amplifikácie v kontexte PCR nakoniec zahrnuje nasledujúce kroky:

  • Extrakcia genetického materiálu (DNA alebo RNA) z testovaného materiálu.

    Pri skúmaní RNA sa musí kódová sekvencia ribonukleovej kyseliny najskôr previesť na kódovú sekvenciu DNA, čo sa musí vykonať pomocou enzýmu „reverzná transkriptáza“v analytickom kroku pred skutočnou amplifikáciou

  • Amplifikácia genetického materiálu v niekoľkých krokoch („cykloch“):

    • Prvý krok - „denaturácia DNA“: zahriatím (95 ° C) dvojvláknovej DNA sa roztaví na jednotlivé vlákna.
    • Krok dva - „Žíhanie“: pri nižšej teplote (približne 55 ° C) sa teraz môžu priméry pripojiť k svojim cieľovým sekvenciám DNA.
    • Krok tretí - „predĺženie“: pri teplote 72 ° C enzým Taq polymeráza teraz predlžuje („predlžuje“) štartovaciu sekvenciu priméru pomocou takzvaných „nukleotidov“(jedná sa o stavebné bloky DNA) a vytvára ju týmto spôsobom nová podlhovastá molekula DNA.

Pretože kroky jeden až dva sa opakujú v niekoľkých cykloch, vytvárajú sa čoraz dlhšie novo vytvorené reťazce DNA, od čoho sa odvíja aj názov tohto laboratórneho procesu „polymerázová reťazová reakcia“.

  • Analýza novovytvorených reťazcov DNA (tzv. „Produkty PCR“):

    Na konci reťazovej reakcie (cykly) sa produkty PCR - tj. Novo vytvorené molekuly DNA - preskúmajú a kvalitatívne alebo kvantitatívne vyhodnotia. Existuje veľa možností pre toto hodnotenie samotné, väčšinou založené na zafarbení (najmä fluorescenčných farbív) DNA a jej zviditeľnení (pomocou gélovej elektroforézy alebo fotometrickej fluorescenčnej detekcie)

Aké výsledky poskytuje PCR?

Výsledky moderných metód PCR možno zhrnúť do dvoch skupín:

  • kvalitatívne a
  • kvantitatívne výsledky.

Pri kvalitatívnej PCR sa skúma, či je v testovanom materiáli prítomná určitá časť genetického materiálu (DNA alebo RNA) („pozitívny“výsledok) alebo nie („negatívny“výsledok).

Kvalitatívna PCR sa preto používa hlavne na objasnenie nasledujúcich diagnostických otázok (výsledky „áno / nie“):

  • Diagnostika dedičných chorôb,
  • Objasnenie mutácií,
  • Uznanie genetických vlastností (napr. Predispozícia k určitým chorobám) atď.

Kvantitatívna PCR je ďalším vývojom tejto laboratórnej metódy, pri ktorej sa zisťuje nielen prítomnosť určitej oblasti genetického materiálu, ale aj množstvo genetického materiálu. Podľa toho sa kvantitatívna PCR používa hlavne v nasledujúcich oblastiach medicíny:

  • V rámci diagnostiky infekcie je možné presne určiť množstvo patogénov v tele pacienta. V prípade vírusových infekcií sa táto metóda PCR používa na liečbu tzv

    Skúmala sa vírusová záťaž

Okrem toho je kvantitatívna PCR veľmi dôležitá aj v základnom výskume, pričom z tohto procesu má úžitok nielen humánna medicína, ale aj celý rad ďalších vedeckých oblastí (veterinárna medicína, biochémia, biológia atď.).

Výhodou PCR v diagnostike infekčných chorôb je, že výsledky testov tejto laboratórnej metódy sú k dispozícii mimoriadne rýchlo (zvyčajne do jedného pracovného dňa). PCR je navyše vysoko citlivá laboratórna metóda. To znamená, že aj najmenšie množstvo baktérií alebo vírusov v testovanom materiáli vedie k spoľahlivo pozitívnemu výsledku.

Existujú nejaké ďalšie zmeny v konvenčnej PCR?

Špeciálnym ďalším vývojom metodológie PCR je

Multiplexná PCR

V multiplexnej PCR sa používa niekoľko cieľových sekvencií DNA (prečítané: niekoľko primérov) súčasne. Tak sa vytvorí zmes produktov PCR, ktoré sa musia zodpovedajúcim spôsobom detegovať a vyhodnotiť.

Multiplexná PCR sa tiež primárne používa v medicíne

  • aj ľudská genetika
  • diagnóza infekcie.

Výhodou tejto metódy je, že od pacientov je potrebné získať celkovo menej testovacieho materiálu a v jednom analytickom kroku je možné vytvoriť sériu výsledkov testov. Tieto výhody v oblasti diagnostiky sú však v mnohých prípadoch vyvážené vysokou cenou za analýzu.

Ďalšou špecialitou na použitie PCR je laboratórny proces

Sekvenovanie DNA

Toto je diagnostická možnosť na dešifrovanie presnej sekvencie genetického kódu u pacienta. Metóda sekvenovania môže byť tiež založená na technológii PCR.

Pretože je však sekvenovanie podstatne zložitejšie a nákladnejšie ako pri bežných metódach PCR, je v súčasnosti vyhradené pre špeciálne diagnostické (analýza rozšíreného genómu) a vedecké problémy.

Aké sú hlavné oblasti použitia PCR?

Pokiaľ ide o oblasti použitia PCR v humánnej medicíne, tento laboratórny postup sa používa pri nasledujúcich diagnostických otázkach:

  • Objasnenie dedičných chorôb - už existuje metóda PCR pre viac ako 600 rôznych dedičných chorôb.
  • Farmakogenetika - štúdiom genetických charakteristík metabolizmu pečene možno vyvodiť závery o účinnosti a dávkovaní liekov.
  • Nádorová medicína („onkológia“) - tu sa na jednej strane PCR používa na objasnenie rizikových faktorov pre určité nádorové ochorenia (napr. Rakovina prsníka). Na druhej strane bunky a tkanivá v nádoroch, ktoré sa už vyskytli, je možné skúmať aj z hľadiska rôznych mutácií, ktoré hrajú čoraz dôležitejšiu úlohu najmä pri liečbe týchto chorôb.
  • Súdne lekárstvo („súdne lekárstvo “) - tu má PCR veľký význam napríklad v konaniach o otcovstve a v kriminalistike („DNA fingerprinting“).
  • Infekčné liečivo - PCR má nenahraditeľnú hodnotu pri diagnostike, progresii a kontrole liečby bakteriálnych, vírusových a parazitárnych infekčných chorôb.

Ďalšie informácie o rakovine nájdete v časti Rakovina.

Existujú referenčné hodnoty pre výsledky testov PCR?

Pokiaľ ide o referenčné hodnoty v metódach PCR, je potrebné vždy brať do úvahy príslušnú diagnostickú otázku. Pretože sa určité genetické znaky zisťujú ako súčasť vyšetrovania dedičných chorôb (napr. Mutačná analýza), v takýchto laboratórnych analýzach nie je referenčná hodnota („pozitívna“alebo „negatívna“), rovnako napríklad neexistuje referenčná hodnota pre farbu vlasov. Pretože farba vlasov je tiež genetická vlastnosť.

Okrem toho laboratórne analýzy vrodených dedičných znakov podliehajú v tejto krajine prísnym predpisom, pre ktoré sú smerodajné ustanovenia rakúskeho zákona o genetickom inžinierstve (GTG) (stanovenie existujúcej choroby podľa §65 GTG). Vo výsledku môže túto analýzu vykonať iba lekárske laboratórium po písomnom potvrdení vyšetrovanej osoby, rodiča alebo zákonného zástupcu (v prípade maloletých osôb, ktoré nie sú schopné rozhodnúť), alebo zákonného zástupcu (v prípade osôb, ktoré nie sú schopné rozhodovať) o komplexných informáciách poskytnutých s ohľadom na tento genetický test je potrebné vykonať ošetrujúceho lekára (§ 69 GTG)

Pacienti majú ďalej všeobecne právo zakázať vykonávanie genetických testov na sebe.

Pre laboratórne analýzy nehumánnej genetickej PCR však platia oveľa menej prísne predpisy. Väčšinou sa jedná o laboratórne metódy z oblasti diagnostiky infekcií.

Pokiaľ ide o referenčné hodnoty týchto laboratórnych metód, je potrebné rozlišovať medzi kvalitatívnymi a kvantitatívnymi metódami:

Kvalitatívne metódy PCR všeobecne poskytujú „pozitívny“alebo „negatívny“výsledok, pričom „negatívny“je vo väčšine prípadov referenčnou hodnotou

Pri kvantitatívnej metóde PCR sa v závislosti na metóde definujú príslušné prahové hodnoty (tzv. Medzné hodnoty), od ktorých sa má výsledok hodnotiť ako patologický.

Populárna podľa tém